Blue Native PAGE凝膠電泳常見問題
Blue Native PAGE凝膠電泳常見問題
1. 在非變性條件下，使用Blue
Native PAGE凝膠進行非變性電泳比使用Tris-甘氨酸凝膠具有哪些優(yōu)勢？
需要使用非離子洗滌劑進行增溶的樣品不能兼容傳統(tǒng)的非變性Tris-甘氨酸PAGE，因為隨著蛋白質在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移，會將非離子洗滌劑遺留在條帶上方。當缺少非離子洗滌劑時，蛋白質會聚集并在泳道頂部形成垂直線條。當使用藍色非變性電泳（Blue Native PAGE凝膠）時，Coomassie G-250可顯著減少蛋白質的聚集，有效分離膜上的蛋白質復合物，達到Tris-甘氨酸凝膠上得不到的效果。此外，與Tris-甘氨酸系統(tǒng)的工作pH（pH 9.3–9.5）相比，Blue
Native PAGE凝膠較低的工作pH（pH 7.5–7.7）有助于維持堿性pH敏感型蛋白質的非變性結構和/或活性。
2. Blue
Native PAGE凝膠應如何保存？
我們推薦將其保存在4-8℃。不可冷凍。
3. Blue
Native PAGE凝膠的蛋白分離范圍是多少？
3-12%RealPAGE Native BN/CN 預制膠可分離分子量在45–10,000 kD范圍內的蛋白質。
4-16%RealPAGE Native BN/CN 預制膠可分離分子量在25–10,000 kD范圍內的蛋白質。
4. Blue
Native PAGE凝膠的推薦樣品上樣體積和蛋白質上樣量是多少？
我們提供的預制膠是12孔，每個孔的最大上樣體積為30 μl，推薦每個泳道的蛋白含量范圍在20-50 μg。
5. 我的Blue Native PAGE凝膠在電泳過程中停止電泳了,為什么？該如何繼續(xù)電泳？
在Blue Native
PAGE凝膠電泳期間，電流下降至低于1 mA很常見。有些電泳電源如伯樂電源有負載檢查功能，電流過低（低于4mA） 會認為沒有負載，報錯E1錯誤代碼，終止電泳。解決方法是更換電泳電源，如使用國產(chǎn)電源；另外可以調高電壓高于300 V，使得電流不要低于4mA。
6. Blue Native電泳有配套的蛋白Marker嗎？
推薦使用RTD6137 非變性電泳蛋白質Marker（45-880 kD），RTD6142 高分子量非變性電泳蛋白質Marker II（45-669 kD）或者RTD6144 寬分子量非變性電泳蛋白質Marker 21-880 kD。然而由于凝膠濃度較低，低于45 kD條帶會壓在前沿，可能不可見。
在Blue Native
PAGE電泳中，不能使用預染分子量Marker，因為所有的預染蛋白分子量Marker都是經(jīng)過變性和還原的，在非變性凝膠上不能良好分離。
請注意，即使使用非變性分子量Marker，在非變性電泳中的分子量預估也是非常不精確的，因為各蛋白質的不同電荷和結構會嚴重影響凝膠遷移。為獲得更精確的預估，可使用質譜分析或排阻層析（SEC）。
7. 你們推薦對Blue Native PAGE凝膠使用哪種染色方法？
Blue Native PAGE凝膠可兼容大多數(shù)標準Coomassie
R-250或G-250染料配方。推薦使用FastBlue蛋白染色液（貨號：RTD6202）。
8.
5% G-250染料的作用是什么？是否含有洗滌劑？
5% G-250染料（貨號BC260）是一種濃縮型Coomassie G-250儲液，專為與含有洗滌劑（非離子型）的Blue Native
PAGE凝膠電泳樣品一起使用而設計。該染料不含洗滌劑。正常情況下，非變性蛋白在凝膠上的遷移取決于凝膠緩沖液pH下的自然電荷/等電點，但是，加入Coomassie G-250會使蛋白質產(chǎn)生負電荷，即使是通常具有正電荷的高pI蛋白質也能帶上負電。該添加劑能夠與蛋白質非特異性結合，能夠保持蛋白的非變性狀態(tài)。
9. 你們推薦選擇哪種轉膜緩沖液用于Blue Native PAGE凝膠轉?。?span>
我們推薦選擇10×BN轉膜緩沖液（貨號：BC600P）用于Blue Native PAGE凝膠轉印。PVDF是推薦使用的印跡膜，具有良好的轉印和檢測效果。硝酸纖維素膜（NC膜）不能兼容Blue Native PAGE凝膠轉印，這是因為硝酸纖維素膜可與Coomassie
G-250染料發(fā)生緊密結合，很難脫離干凈。
10. 對于Blue Native PAGE凝膠，你們推薦的轉膜條件是什么？
由于Blue Native
PAGE電泳基本關注的是分子量比較大的蛋白或復合體，推薦使用濕轉法轉膜（貨號：RT-ZY01），不推薦用半干轉方法轉膜。使用BN轉膜緩沖液，以下轉膜條件僅供參考，客戶針對自己的目的蛋白，最好經(jīng)過1-2次預實驗后，確定最佳的轉膜條件。
|
蛋白大小
|
穩(wěn)流
|
建議時間
|
降溫措施
|
|
低于70kD
|
150 mA
|
1 小時
|
不需要
|
|
70-300 kD
|
200 mA
|
1.5-2 小時
|
需要
|
|
高于300 kD
|
200 mA
|
2.5-3.5 小時
|
需要
|
11. 凝膠轉膜后，我的PVDF膜染上藍顏色了怎么辦？
由于電泳緩沖液和上樣緩沖液中含有考馬斯亮藍G-250，凝膠轉膜后PVDF膜會有藍色痕跡，可以把膜浸泡在無水甲醇中漂洗幾分鐘，去除藍色。
12. 非變性Marker轉到膜上看不到條帶，Western Blot檢測后我如何判斷條帶大小呢？
有兩種方法可以解決非變性Marker轉膜后條帶顯示問題：
第一種方法：凝膠轉膜后用麗春紅染色液（貨號：RTD6301）染膜，可以看到Marker條帶，順便可以檢測轉膜效率，然而要注意的是麗春紅染色靈敏度比較低，可能不能完全看到完整的Marker條帶。
注：北京師范大學惠贈圖片
第二種方法（下圖）：電泳結束后，把含有Marker泳道的凝膠切下，單獨用FastBlue蛋白染色液（貨號：RTD6202）染色，剩余的凝膠去完成轉膜到ECL發(fā)光檢測過程，最后的發(fā)光結果和Marker染色結果拼接判斷條帶范圍。
Jurkat細胞BN電泳 GAPDH檢測
電泳：1×藍色電泳緩沖液（含0.01% G-250）
穩(wěn)壓150V 43分鐘；1×無色電泳緩沖液 穩(wěn)壓150V 35分鐘
轉膜：1×BN轉膜緩沖液（不含甲醇），穩(wěn)流200 mA
（電壓72-60V） 1.5小時，未冰浴
膜漂洗去藍色：PVDF膜無水甲醇浸泡10分鐘至膜無色
一抗：GAPDH兔多抗（貨號：
RGA1040），1：5000 過夜孵育
二抗：羊抗兔IgG-HRP（貨號：
HGR1020） 1：5000 RT 1小時
ECL檢測：ECL發(fā)光（貨號：
EC2520），曝光3.5 min