藍(lán)色預(yù)染超低分子量蛋白質(zhì)Marker（3.3-31
kD）
Blue Ultra Low Molecular Weight Protein
Marker (3.3-31 kD) Ver750260-1.0
●產(chǎn)品編號(hào)及規(guī)格：
RTD6152 10次（100 μl）
● 貯存、運(yùn)輸及效期：
-20℃貯存；濕冰運(yùn)輸；有效期12個(gè)月。
● 產(chǎn)品簡(jiǎn)介：
本產(chǎn)品包含預(yù)染的3種多肽和2種低分子量蛋白質(zhì)組成，分子量大小范圍為~3. 3，~6.5，~14.4，~20.1，~31
kD?？梢杂糜谥苯佑^察蛋白質(zhì)電泳狀況以及清晰地判斷Western Blot的轉(zhuǎn)膜效果。經(jīng)Tricine-甘油SDS-PAGE凝膠電泳時(shí)以及轉(zhuǎn)移到PVDF或NC膜上可看到清晰的5條藍(lán)色的蛋白條帶。以每次上樣10 μl計(jì)算，該產(chǎn)品可以使用20次。
● 使用說(shuō)明：
第一次收到該產(chǎn)品，常溫融化后，徹底混勻，離心快甩將溶液完全收集到管底。本產(chǎn)品為即用型，溶化后既能使用，不能95℃加熱處理。
一. 制膠：
先配制分離膠，聚合后再配制夾層膠，最后配制濃縮膠，3種膠的制膠體積比約為4.5:1.5:1.5（注：表一中夾層膠和濃縮膠配制體積是過(guò)量的，制膠時(shí)不要全部加入）。
1.1 配制分離膠：
1.1.1 按照表一將不同體積的組份加入到小燒杯中混合。
1.1.2 加入10%APS和TEMED，立即混勻以使溶液混勻。
1.1.3 在玻璃板中灌入分離膠溶液，然后輕輕覆蓋一層1-3 cm的無(wú)水乙醇，使凝膠表面保持平整。
1.1.4 靜置10-20分鐘，待分離膠和乙醇層之間出現(xiàn)一個(gè)清晰的界面表示凝膠已聚合。
注：凝膠的聚合時(shí)間與環(huán)境溫度有關(guān)。夏天溫度較高時(shí)，聚合較快；冬天氣溫低時(shí)，聚合時(shí)間會(huì)延長(zhǎng)。分離膠37℃約10分鐘，25℃約15分鐘，18℃ 約20分鐘可以聚合。
1.2 配制夾層膠：
1.2.1 去除覆蓋在分離膠上的醇，用濾紙將殘留的醇吸去。
1.2.2 按照表一將不同體積的組份加入到小燒杯中混合。
1.2.3 加入10%APS和TEMED，立即混勻使溶液混勻。
1.2.4 在玻璃板中灌入適量夾層膠溶液，然后在溶液上輕輕覆蓋一層1-3cm的無(wú)水乙醇，使凝膠表面保持平整。注：此溶液為過(guò)量，請(qǐng)勿全部注入。
1.2.5 靜置20-30分鐘，待夾層膠和乙醇層之間出現(xiàn)一個(gè)清晰的界面表示凝膠已聚合。
注：凝膠的聚合時(shí)間與環(huán)境溫度有關(guān)。夏天溫度較高時(shí)，聚合較快；冬天氣溫低時(shí)，聚合時(shí)間會(huì)延長(zhǎng)。夾層膠37℃ 20分鐘，25℃ 25分鐘，18℃ 約30分鐘可以聚合。
1.3 配制濃縮膠
1.3.1 去除覆蓋在夾層膠上的乙醇，用濾紙將殘留的醇吸去。
1.3.2 按照表一將不同體積的組份加入到小燒杯中混合。
1.3.3 加入10%APS和TEMED，立即混勻，以使溶液充分混勻。
1.3.4 將梳子插入凝膠內(nèi)，避免產(chǎn)生氣泡。
1.3.5 靜置20-40分鐘裝待凝膠聚合。
注：凝膠的聚合時(shí)間與環(huán)境溫度有關(guān)。夏天溫度較高時(shí)，聚合較快；冬天氣溫低時(shí)，聚合時(shí)間會(huì)延長(zhǎng)。濃縮膠37℃ 20分鐘，25℃ 30分鐘，18℃ 40分鐘可以聚合。
表一
（一塊1 mm 厚度小板膠用量）
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分離膠
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夾層膠
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濃縮膠
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16.5%T6%C/4.5
ml
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10%T3%C/2
ml
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5%T3%C/2
ml
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49.5%T
3%C
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/
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0.4
ml
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0.2
ml
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49.5%T
6%C
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1.5
ml
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/
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/
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4×凝膠緩沖液
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1.125
ml
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0.5
ml
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0.5
ml
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50%甘油（v/v）
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0.9
ml
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-
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-
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ddH2O
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0.95
ml
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1.1
ml
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1.3
ml
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10%APS
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~45
μl
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~20
μl
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~20
μl
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TEMED
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~4.5
μl
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~2
μl
|
~2
μl
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注：如非必須，不要使用1.5mm厚度的凝膠，這樣會(huì)減少電泳后染色和脫色的時(shí)間。
二. 電泳：
2.1 電泳緩沖液配制：
電泳前，將10×陽(yáng)極緩沖液（Cat No:AB080）和10×陰極緩沖液（Cat No:CB010）用蒸餾水稀釋成1×緩沖液備用。
2.2 樣品處理：
待上樣的檢測(cè)樣品與2×Tricine上樣緩沖液(Cat:TP050)等體積混合，95℃處理5分鐘后上樣。蛋白Marker一般已經(jīng)含有上樣緩沖液，預(yù)染Marker不能加熱處理，混勻后直接上樣，非預(yù)染Marker一般需要95℃處理5 min后上樣。
2.3 電泳：
將電泳槽的外槽加入1×陽(yáng)極緩沖液，內(nèi)槽加入1×陰極緩沖液，輕柔拔出梳子，將Marker或蛋白樣品加入點(diǎn)樣孔，穩(wěn)壓電泳（電泳條件參考下表）
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濃縮膠
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恒壓 30 V
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35-45 min
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夾層膠
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恒壓 80 V
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30-40 min
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分離膠
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恒壓 120 V
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80-100 min
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待指示前沿到達(dá)分離膠下沿時(shí),即可停止電泳，電泳時(shí)間總計(jì)2-4小時(shí)
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三. 凝膠檢測(cè)：
注：多肽染色可以用配方7和8（表二）進(jìn)行染色和觀察。如果使用該配方進(jìn)行染色時(shí)效果不好或考慮其毒性，請(qǐng)選擇FastBlue蛋白染色液（Cat
No：RTD6202），該產(chǎn)品能在60分鐘之內(nèi)完成蛋白的染色，不至于小肽在染色和脫色中從凝膠中脫離，是常規(guī)染色液的理想替代品。
3.1
染色（以FastBlue蛋白染色液染色為例）：
3.1.1
將電泳后的PAGE膠取下放入塑料容器中,用適量蒸餾水漂洗，去除膠表面的SDS，殘余SDS會(huì)導(dǎo)致染色液出現(xiàn)沉淀。
3.1.2
棄蒸餾水，加入適量染色液（以剛剛覆蓋過(guò)膠面為適),搖床上常溫?fù)u動(dòng)，根據(jù)下表確定染色時(shí)間。
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待檢測(cè)蛋白量
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染色時(shí)間
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＞1 μg
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~5分鐘
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100 ng-1 μg
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~10分鐘
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10 ng-100 ng
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~60分鐘
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3.2 轉(zhuǎn)膜：
多肽電泳后轉(zhuǎn)膜選擇孔徑0.22 μm PVDF膜（用前用甲醇處理潤(rùn)濕）或0.22
μm NC膜。
3.2.1
半干轉(zhuǎn)：
使用伯樂(lè)Trans-Blot Turbo半干轉(zhuǎn)機(jī)器請(qǐng)選擇配套的5×RealBlot快速半干轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜緩沖液（貨號(hào)：RT5030），推薦轉(zhuǎn)膜條件:一板小型凝膠(8×10
cm)恒流,1.3 A,10-15 min。
3.2.1
濕轉(zhuǎn)：
濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜緩沖液(25 mM Tris,192 mM Glycine, 0.01%SDS，20%
Methanol,pH~8.3），可以選擇10×Tris-甘氨酸轉(zhuǎn)膜緩沖液（貨號(hào)：TB1040）。推薦轉(zhuǎn)膜條件：恒流200
mA 40-60 min。
四.小分子蛋白質(zhì)SDS-PAGE電泳試劑配制：
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1.
49.5%T3%C PAA(Cat:PS080)
丙稀酰胺 48 g
甲叉雙丙稀酰胺 1.5 g
用ddH2O溶解后定容至100
ml，
過(guò)濾后使用。
貯存：4℃
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2.
49.5%T6%C PAA（Cat:PI080）
丙稀酰胺 46.5 g
甲叉雙丙稀酰胺 3 g
用ddH2O溶解后定容至100
ml，
過(guò)濾后使用。
貯存：4℃
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3.
4×凝膠緩沖液(Cat:GB010）
[4
M Tris; 0.4% SDS; pH8.45]
Tris堿 48.4 g
ddH2O 80 ml
0.4
g SDS或4 ml 10％ SDS
用HCl調(diào)pH值至8.45
25℃.
用ddH2O定容至100
ml；貯存：4℃
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4.
10×陽(yáng)極緩沖液（Cat:AB080）
[2
M Tris pH8.9]
Tris堿 121.1 g
ddH2O 400 ml
用HCl調(diào)pH值至8.9
用ddH2O定容至500
ml
貯存：4℃
注：使用前稀釋成1×陽(yáng)極緩沖液使用。
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5.
10×陰極緩沖液（Cat:CB010）
[1M
Tris;1M Tricine;1% SDS;pH 8.3]
Tris堿 121.14 g
Tricine 179.2 g
SDS
10 g
用水溶解，定容至1000
ml(不用調(diào)pH)。
貯存：4℃
注：使用前稀釋成1×陰極緩沖液使用
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6.
2×Tricine多肽上樣緩沖液(變性,還原)
(Cat:TP050)
2
ml 1M Tris-Cl pH6.8
5
g 甘油
0.2
g SDS
0.2
g DTT（或者400 μl β-巰基乙醇）
4
mg 考馬斯亮藍(lán)G-250
用滅菌ddH2O定容至10
ml
混勻分裝-20℃貯存?zhèn)溆?/span>
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7. 染色液
冰醋酸 100 ml
考馬斯亮藍(lán)G-250 0.25 g
水 900 ml
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8. 脫色液
冰醋酸 100 ml
水 900 ml
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9.
50%甘油
甘油 50 ml（63克）
超純水 定容到100
ml
貯存：4℃
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實(shí)驗(yàn)示例：
